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原代細胞的培養(yǎng)：

原代細胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。

原代細胞的培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。

組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進行培養(yǎng)。

分散細胞培養(yǎng)大致步驟為:

將動物組織從機體中取出離散成單個細胞(常用)，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖(注意整個過程無菌)。

原代細胞操作方法：

（1）取成年新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射空氣處死后，取下兔子的雙腿，立即用75%乙醇浸泡。

（2）移入細胞房內(nèi)，去除雙腿表面的皮毛及肌肉，剪取關(guān)節(jié)段，移至超菌工作臺內(nèi)。

（3）PBS洗滌數(shù)次，用手術(shù)刀或彎剪將關(guān)節(jié)表面的軟骨組織取下。

（4）軟骨組織塊靜置5min，棄去上層液體及懸浮組織，將軟骨組織剪成1mm3的大小。移到離心管中加3倍體積的0.25%，置入37℃的恒溫搖床中，振蕩消化15-20min；

（5） 4℃靜置5min；棄上清，PBS洗滌，去上清。加入0.2%膠原酶II，置入37℃的恒溫搖床中，振蕩消化2H；

（6）加入生長培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打后依次通過200目濾網(wǎng)。收集濾液,1200rpm離心8min，棄上清，用DMEM*培養(yǎng)基重新懸浮細胞, 放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

（7）細胞傳代后放入預(yù)置有薄骨片或蓋玻片的培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。細胞*展開后即可固定做原代鑒定。

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