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上海晶抗生物多重PCR試劑盒簡(jiǎn)介：

多重PCR試劑盒是一種在普通PCR基礎(chǔ)上建立的一種可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段的檢測(cè)多種細(xì)菌分子生物學(xué)的技術(shù)，其利用多對(duì)特異性引物同時(shí)擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率，節(jié)省了成本。優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)的速度快、準(zhǔn)確性高和操作簡(jiǎn)單，特別適用于臨床、環(huán)境和食品檢測(cè)等領(lǐng)域。

原理：

多重PCR試劑盒快速檢測(cè)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則從而完成單鏈DNA的延伸工作，最終完成DNA雙鏈的配對(duì)合成。

多重PCR與常規(guī)PCR的區(qū)別在于同一個(gè)反應(yīng)體系中所加入的引物對(duì)數(shù)不同。多重PCR可以特異性擴(kuò)增出多條目的DNA片段。反應(yīng)體系的組成和PCR循環(huán)的條件需要經(jīng)過優(yōu)化以確保同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。理論上只要PCR擴(kuò)增的條件合適，引物對(duì)的數(shù)量可以不限，但由于各種條件的限制，實(shí)際能夠擴(kuò)增的引物對(duì)數(shù)量是有限的（～1000對(duì)）。

材料與儀器：

目的菌株，胰蛋白胨，細(xì)菌DNA提取試劑盒，LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基；PCR熱循環(huán)儀，PCR擴(kuò)增儀等。

步驟：

1. 引物設(shè)計(jì)：選擇序列長(zhǎng)度在500bp以上的基因設(shè)計(jì)引物。先用Primer軟件，之后通過Oligo軟件和BLASTN算法進(jìn)行分析，選擇二聚體少，自身不會(huì)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，Tm值在60℃左右且與非DNA同源性較低的引物作為該基因的特異性引物，并送公司進(jìn)行合成。最好進(jìn)行引物評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

2. 提取目的菌株DNA：吸取樣品勻液，5000r/min離心后棄去上清，參照細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行操作，提取樣品的基因組DNA。

3. 測(cè)定DNA濃度及純度：當(dāng)260nm/280nm的比值在1.8-2.0之間表明提取的基因組DNA質(zhì)量較好。

4. 多重PCR檢測(cè)：將所提取的基因組DNA作為模板，以設(shè)計(jì)的引物（SU4,smal，clfA）進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，25μL多重PCR反應(yīng)體系為：2.5Μl10XPCRBuffer，1.0μLMgCl2（4mM），2.5μLdNTPMixture（各2.5mM），0.5μLTaq酶（5.0U），2.0μLDNA模板，引物（10umol），添加SU4,smal，clfA分別為2.6μL、0.5μL、1μL，ddH2O補(bǔ)足至25μL。

5. PCR反應(yīng)程序?yàn)椋孩?4℃5min；②94℃30s；③58℃30s；④72℃45s；⑤72℃10min。②-④步重復(fù)30次。

6. 配置1.5%瓊脂糖凝膠，使用電泳檢測(cè)多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

7. 在EB液中染色10~15分鐘后置于凝膠成像儀下查看電泳條帶結(jié)果。

注意事項(xiàng)：

1. 當(dāng)比值大于2.0表明提取的基因組DNA中RNA含量較高，應(yīng)加入一定量的RNase酶去除溶液中的RNA。

2. 目的片段長(zhǎng)度不盡相同，而較小片段總是優(yōu)先擴(kuò)增；

3. 各對(duì)引物最佳PCR條件不相同，較長(zhǎng)的片段需要較長(zhǎng)的延伸時(shí)間。為了保證最終擴(kuò)增產(chǎn)量的一致性，在優(yōu)化反應(yīng)條件的時(shí)候，盡可能選擇有利于較大片段的擴(kuò)增條件。

4. 多重PCR體系中，引物用量與擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度有著正比內(nèi)在關(guān)系，即擴(kuò)增片段越長(zhǎng)，所需引物相對(duì)越多，另外引物間的相互影響會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效果不佳。

5. DNA聚合酶的最適濃度為每25uL反應(yīng)體積中添加2U，實(shí)際根據(jù)擴(kuò)增效果進(jìn)行輕微調(diào)整。

6. 高鹽濃度會(huì)使長(zhǎng)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物難于變性解鏈。因而長(zhǎng)片段產(chǎn)物在低鹽濃度下擴(kuò)增效果較好，而短片段產(chǎn)物在高鹽濃度下擴(kuò)增效果較好?？梢赃m當(dāng)提高PCR緩沖液濃度，或者提高K+濃度至70~100mM。

7. 不同的細(xì)菌類型和樣品類型可能需要不同的提取和擴(kuò)增方法，需要根據(jù)具體情況選擇合適的方法。同時(shí)在進(jìn)行PCR試劑盒擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，需注意控制反應(yīng)條件和減少污染，以確保準(zhǔn)確性和可靠性。

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