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晶抗生物小鼠5羥色胺4(5-HT4)elisa試劑盒操作事項介紹如下

標(biāo)本要求：

1、血清：

室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

2、血漿:

應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成應(yīng)再次離心。

3、尿液：用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉定形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。

4、細(xì)胞培養(yǎng)上清：

檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。

5、培養(yǎng)細(xì)胞：

檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分》。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉定形成，應(yīng)再次離心。

6、組織標(biāo)本:

切割標(biāo)本后，稱取重里。加入一定里的PBS，PH7.4。用液氛迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定里的PBS（PH7.4)，或組織蛋白萃取試劑，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

7、標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于一20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

8、不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：

1、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，依次進行稀釋數(shù)倍。

2、加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50H1，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40日1，然后再加待測樣品10日1（樣品終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡里不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3、溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4、配液：將30倍（48T的20倍）濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用

5、洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6、加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50比1，空白孔除外。

7、溫育：操作同3。

8、洗滌：操作同5。

10、顯色：每孔先加入顯色劑A50H1，再加入顯色劑B50H1，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘

11、終止：每孔加終止液50H1，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色》。

12、測定：以空白空調(diào)零，450m波長依序測量各孔的吸光度（0D值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

操作事項：

1、小鼠5羥色胺4（5一HT4）elisa試劑盒準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用達(dá)到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2、加樣：加樣或加試齊，請注意在吸取標(biāo)本/標(biāo)準(zhǔn)品，酶結(jié)合物或底物時，個孔與后一個孔加樣之間時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的“預(yù)孵育"時間，從而明顯地影響到測里值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）好控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)里多，推薦使用多道移液器加樣。

3、孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)：同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。

4、洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5、試齊酒制：DetectionA及DetectionB在使用請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的里配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請精確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡里不要微里配置（如吸取檢測溶液時，一次不要小于10日1），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

6、反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)峒尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7、底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數(shù)。

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